AUS DEM INSTITUT FÜR PATHOLOGIE ABTEILUNG FÜR NEUROPATHOLOGIE IM KLINIKUM BENJAMIN FRANKLIN DER FREIEN UNIVERSITÄT BERLIN

KOMMISSARISCHER LEITER: PROF. DR MED. W. HINKELBEIN

DIE AUSWIRKUNG CHRONISCHER PRÄ- UND POSTNATALER QUECKSILBERBELASTUNG AUF DIE

STÄRKE DER REAKTIVEN ASTROGLIOSE IN DER MEDULLA OBLONGATA INNERHALB DER ERSTEN 24 LEBENSMONATE DES MENSCHEN

-EINE UNTERSUCHUNG AN 76 LEICHEN-

INAUGURAL-DISSERTATION ZUR ERLANGUNG DER DOKTORWÜRDE DES FACHBEREICHES HUMANMEDIZIN DER FREIEN UNIVERSITÄT BERLIN

VORGELEGT VON CHRISTIAN THOMAS KEIM AUS

AUS KARLSRUHE

Modell Ober eine mögliche molekulare Basis der Wirksamkeit von Quecksilberverbindungen auf die Proteinbiosynthese nach D. Kusznetsov (1990)

Autor Hirnareal Mittelwert Spannweite Fallzahl

ng/g Hg ng/g Hg n

Schiele (1981) GHR <5* <5-17 51

GHM <5* <5-16 51

KH 6,3* <5-26 51

Tucek(1981) HS 8,4 1,7-69,9 82

Rungby (1983) <10

Warren GH 4,2 0,3-14 27

KH 6,2 1,2-18 27

Schiele (1984) GHR 9,9 0,5-44 44

Friberg(1986) GHR 12,4 4,8-28,7 17

KH 11,2 3,6-33,8 15

Abadi (1987) 22,8 15,1-43,7 20

Allhoff (1987) 13,04 <5-78 53

Eggleston (1987) Gesamtgruppe GHR 12,7 1,9-121,4 83

Gesamtgruppe GHM 8,7 1,3-110,1 60

0-1 Amalgamflächen GHR 6,7 1,9-22,1 16

0-1 Amalgamflächen GHM 3,8 1,4-7,1 13

5-14,5 GHR 15,2 3-121,4 51

Amalgamflächen

5-14,5 GHM 11,2 1,7-110,1 35

Amalgamflächen

Nylander (1987) GHR 10,9 2,4-28,7 34

KH 11,2 3,6-33,8 19

Noda (1988) GHR 41 17-127 42

GHM 19 3-24

KH 54 15-137 42

Schiele (1988) GHR 5,1 <5-44

Bauer (1989) GHR 4,96 0,46-16,12 48

Nylander (1989) GHR 11 2-29 20

Nylander (1990) GHR 9,9 2,4-22,8 12

Nylander (1991) GHR 10,6 2,4-22,9 17

Drasch (1992) Teilgruppe 0-2 Amalgamfüllungen GHR 15,40 (Angaben nur für Gesamtkollektiv) 39

GHM 10,97 39

KH 12,69 39

HS 12,62 39

Teilgruppe > 10 Amalgamfüllungen GHR 21,3 19

GHM 19,8 19

KH 15,88 19

HS 15,69 19

Tabelle 1 (* = Angaben für den Median)

Angaben über Normalwerte für Gesamtquecksilber im Gehirn von nicht belasteten Personen

zitierte Arbeiten). Die kritischen Werte gelten in der Regel für chronische, langjährige Belastung.

Aufgenommen wurden die niedrigsten gefundenen Werte, die nach einzelnen Arbeiten zu Symptomem führten, sofern nicht eine große Anzahl von Studien die Ergebnisse widerlegte. Zur kritischen Würdigung siehe im Kapitel Diskussion.

In der Tabelle angegeben sind Orientierungswerte auf Gruppenbasis für Hg für Blut, Urin, Gehirn bzw. Haare. Für Blut und Gehirn entsprechen die Angaben in der Regel dem Gesamtquecksilbergehalt. Die Werte im Haar beziehen sich in der Regel auf den Gesamtquecksilbergehalt - respektive auf den Gehalt an organischem Quecksilber. Die Werte im Urin bezeichnen den Gesamtquecksilbergehalt - respektive den Gehalt an anorganischem Quecksilber.

Blut (µg/g Hg) Urin (µg/g Hg) Gehirn (ng/g Hg) Haare (µg/g Hg)

Erwachsene

Normalwerte <5 <5 <20 (Europa) <50 (Japan) <10

Früheste Wirkung (laborchemische Veränderungen) 10-20 20-50

WHO-Grenzwerte 1976 35 150

Deutsche BAT-Werte 50 200

Symptome ab: Parästhesien 50-60

Tremor 70 25-150

Reduzierte Feinbeweglichkeit 10-20" 20-50

Erethismus 50-100

Leichte kognitive Defizite 40-60

EEG-Veränderungen 20

Polyneuropathie 50-100

Pränatale Belastung

Früheste Wirkung laut WHO: 5% Risiko von leichten kognitiven Defiziten 10-20

30% neurologische Auffälligkeiten laut WHO 1990 70

Schwere neurologische Auffälligkeiten laut WHO 1990 400

Tabelle 2: Orientierungswerte für Quecksilbereffekte

1.1.11.4.3 Pränatale bzw. postnatale Belastung im Säuglingsalter

Im Folgenden werden die wichtigsten Studien zur pränatalen, perinatalen und postnatal im

Kindesalter aufgetretenen Quecksilberbelastung aufgeführt:

Irak:

Während es von den Vergiftungskatastrophen in Minamata und Niigata, Japan, wenig Daten über pränatale Belastungen gab, untersuchte zunächst Takeuchi (1977) 23 Kinder aus der Vergiftungskatastrophe im Irak, welche intrauterin mit Methylquecksilber belastet worden waren und später March et al. (1977,1987) 84 Mutter-Kindpaare aus derselben Vergiftungsperiode. Hierbei wurde die immens höhere Empfindlichkeit der Kinder deutlich. Während die Mütter teilweise nur leichte, transiente Symptome aufwiesen, konnten bei ihren Kindern zum Teil Mikroenzephalien, schwere Lähmungen, Anfalle, Einschränkungen von Sehen und Hören sowie eine ausgeprägte zerebrale Retardierung nachgewiesen werden. Marsh et al. versuchten entsprechend den Abschätzungen bei Erwachsenen eine Dosis-Effekt-Relation statistisch auszurechnen. Allerdings gab es auch hier Probleme mit der stat. Sicherheit bei den unteren Belastungsgrenzen wegen der geringen Fallzahl der Kinder in diesem Bereich bei einer nicht exakt bestimmbaren Hintergrundaktivität der beschriebenen Symptome, wie z. B. leichte motorische Retardierung. Als untere Sicherheitsgrenze wurden mütterliche Haarquecksilberwerte von 7,3 µg/g angegeben - allerdings mit einem großen Konfidenzintervall. Schwere Verläufe wurden bei Haarkonzentrationen um 400 µg/g beobachtet. Seychellen:

In der „Seychelles Child Development Study" wurden in einer großangelegten prospektiven Studie die Effekte von prä- und postnataler MeHg-Belastung bei 711 Kindern in einer Seefischesserpopulation untersucht. Auswertungszeitpunkte waren die postnatalen Monate 6, 5,19, 29 und 66. Dabei fanden sich in der letzten Untersuchungsphase 66 Monate nach

Abb. 2

3.5.3.3 Kameraeinstellung

Bei der Kamera wurde vor jedem Bild die automatische Helligkeitsanzeige kontrolliert.

3.5.3.4 Kalibrierung

Vor der Meßserie wurde die Pixelgröße mit Hilfe eines Eichlineals auf einem Objekträger auf die Einheit Mikrometer kalibriert.

3.5.3.5 Messung

Vor der gesamten Meßreihe wurde an zwei mit HE und GFAP gefärbten Schnitten die Farbeichung für die Messung vorgenommen. An einem Schnitt mit schwacher GFAP-Reaktion und einem mit starker GFAP-Reaktion wurde per Mauszeiger die braune GFAP-Farbe so markiert, daß die gesamten GFAP-positiven Zellkörper erfaßt werden, daß aber die mit Hämatoxylin gefärbten Anteile nicht mitreagierten.

Abbildungen 3 und 3a: Probeschnitt zur Farbeichung, Färbung mit HE und GFAP. Schwach ausgeprägte reaktive Astrozytose im Bereich der medianen Raphe (3) sowie binäre Markierung desselben Bildes durch das Quantimetsystem (3a).

Abbildungen 4 und 4a: Probeschnitt zur Farbeichung, Färbung mit HE und GFAP. Stark ausgeprägte reaktive Astrozytose im Bereich der medianen Raphe (4) sowie binäre Markierung desselben Bildes durch das Quantimetsystem.

Darauf wurden nun sämtliche Schnitte mit der selben Einstellung nach dem oben beschriebenen Prinzip vermessen.

Das Ergebnis gibt die Fläche der GFAP-positiven Areale sowohl in absoluten Werten (µm2) als auch relativ im Verhältnis zur vermessenen Gesamtfläche in Prozent an.

3.6 Quecksilberbestimmung mittels Atomabsorptionsspektrometrie

Bei der Quecksilberbestimmung konnte ich als Gast am Institut für Rechtsmedizin der Universität München von den Vorarbeiten der dortigen Doktoranden bei der Methodenentwicklung profitieren. Da ich an den Vorarbeiten nicht beteiligt war und nur die Messungen selbst durchgeführt habe, zitiere ich vor allem zum Thema Methoden und deren Verbesserung weitgehend aus den Arbeiten von B. Schupp (1994) und E. Wanghofer (1997).

3.6.1 Aufschluß

Von den Organproben wurde im angetautem Zustand ein kleiner Würfel abgeschnitten und ca. 1.0 g Gewebe (für die spätere Berechnung auf Milligramm genau gemessen) in ein Reagenzglas mit Schraubverschluß (Nr. 60541, 13 ml aus Polypropylen, Fa. Saratedt, Nümbrecht) gegeben. Der Aufschluß erfolgte dann unter Zusatz von 1 ml konz. (65 %) HNO3 (Suprapur Nr. 441, Fa. Merck, Darmstadt) im Heizwürfel bei 70 Grad Celsius über Nacht. Die entstandene Lösung wurde mit Aqua ad injectabila (Fa. B. Braun Melsungen, Melsungen) auf 5 ml im Meßkolben aufgefüllt und mit CVAAS (Cold Vapor atomic absorption spectrometry) gemessen.

4 Ergebnisse

4.1 Quecksilber

4.1.1 Berlin

Bei den neun Berliner SIDS-Fällen sowie den vier Vergleichsfällen wurden jeweils Proben aus Hirnstamm sowie Frontalhirn entnommen und mittels Atomabsorptionsspektrometrie auf den Quecksilbergehalt hin untersucht. Fehlende Werte erklären sich nicht durch Ausschluß von Werten, sondern durch im Einzellfall fehlende Probenentnahme.

GZ-Nr Alter in Wochen Diagnose Hg Frontalhirn Hg MO

B93/604 12 SIDS 1,99 1,80

B93/623 20 SIDS 2,89 7,39

B94/036 16 SIDS 1,53 0,00

B94/051 10 SIDS 2,03 3,75

B94/077 9 Otitis media 0,00 0,00

B94/157 13 SIDS 0,67 0,58

B94/217 49 Endokarditis 2,68 1,46

B94/262 50 SIDS 0,87 0,00

B94/502 37 Ertrinken k.W. 0,90

B94/547 30 Waterhouse-F.-Syndrom 1,03 0,00

B94/655 16 SIDS k.W. 0,72

B94/658 14 SIDS 0,53 k.W.

B94/695 15 SIDS 0,00 0,00

Tabelle 3: Quecksilberwerte der Berliner Fälle. GZ-Nr = Sektionsnummer, MO = Medulla oblongata

Bei den Berliner SIDS-Fällen fanden sich Quecksilberwerte von „nicht nachgewiesen", kurz „n.n." bis maximal 7,39 ng/g im Bereich des Hirnstammes sowie von n.n. bis 2,89 ng/g im Frontalhirn. Bei den vier Vergleichsfällen zeigten sich Hg-Werte von n.n. bis 1,46 ng/g Hg im Hirnstamm und n.n. bis 2,68 ng/g Hg frontal. Trotz einzelner Ausreißer zeigten sich die Werte damit in Hirnstamm und Frontalhirn in einem ähnlichen Konzentrationsbereich, ohne daß eine statistisch signifikante Tendenz zu höheren Werten in einer der beiden Regionen zu finden war.

Korrelation Hg Frontalhirn/Hg Hirnstamm

? Hg Frontalhirn ¦ Hg MO

Einzelfälle

Abbildung 5: Korrelation der Quecksilberhöhen der Berliner Einzelfälle in Medulla oblongata bzw. Frontalhirn

Die statistischen Kennwerte Median, Arithmetisches Mittel, Varianz und Standardabweichung für die Proben aus Hirnstamm bzw. Frontalhirn aller Berliner Fälle sowie gesondert nur der Berliner SIDS sind in Tab 4 zu finden. Auf Grund der geringen Fallzahl der Vergleichsfälle wurde auf eine statistische Beschreibung dieser Untergruppe verzichtet.

Median Arithmetischer Mittelwert Varianz Standardabweichung

Berlin Alle Hg frontal (ng/g) 1.03 1,285 0,921 0,96

Berlin Alle Hg Medulla obi. (ng/g) 0.65 1,38 4,44 2,11

Berlin SIDS Hg Frontal (ng/g) 1,2 1,3 0,48 0,91

Berlin SIDS Hg Medulla obi. (ng/g) 0,65 1,78 3,37 1,84

Tabelle 4

4.1.2 München

Bei den Münchner Fällen waren bei der Sektion durch die Kollegen der Münchner Rechtsmedizin nur Proben aus dem Frontalhirn für die Quecksilberbestimmung entnommen worden. Werte für den Hirnstamm fehlen somit bei dieser Gruppe.

GZ-Nr Lebensalter in Wochen Diagnose Hg Großhirn

89/1244 65 Hämorrhagische Pneumonie 4,70

89/1270 52 Schädelzertrümmerung nach Unfall 6,10

89/1472 26 SIDS 6,10

89/1500 43 SIDS 6,80

89/1523 65 Erwürgen 11,00

89/1938 43 SIDS 24,60

89/2131 0 Ersticken 4,40

89/2200 13 SIDS 6,60

90/0040 5 SIDS 7,30

90/0255 17 SIDS 2,20

90/0415 35 SIDS 8,60

90/0435 52 Kreislaufversagen bei V.a. Sepsis 8,20

90/0450 78 Ertrinken 25,80

90/0481 10 SIDS 21,30

90/0531 1 Herzbeuteltamponade bei TGA 0,60

90/0558 13 SIDS 16,60

90/0637 104 Ersticken 3,70

91/1357 43 SIDS 1,70

91/1702 30 Unfall, Schädelzertrümmerung 1,70

91/1730 30 SIDS 1,40

91/1909 35 Kreislaufversagen bei M. Down 1,00

91/1933 9 SIDS 2,30

91/2062 52 Schädelbasisbruch 2,70

91/2359 26 SIDS 1,80

91/2361 9 SIDS 2,10

91/2422 22 SIDS 1,90

91/2437 78 Kreislaufversagen bei Virusinfekt 2,30

91/2536 9 SIDS 3,60

92/0010 22 SIDS 3,20

92/0044 7 SIDS 1,50

92/0111 9 SIDS 2,00

92/0115 17 SIDS 3,80

92/0247 9 SIDS 2,80

92/0314 17 SIDS 2,80

92/0320 9 SIDS 3,70

92/0385 16 SIDS 3,60

92/0405 78 Ersticken bei Laryngitis 2,50

GZ-Nummer Lebensalter in Wochen Diagnose Hg Großhirn

92/0416 9 SIDS 2,00

92/0436 78 Hirndruckerhöhung bei Allg.-Infektion 3,20

92/0482 30 SIDS 7,90

92/0489 61 Ersticken 1,60

92/0493 91 Ertrinken 10,90

92/0560 13 SIDS 15,00

92/0565 26 SIDS 2,80

92/0607 9 SIDS 5,50

92/0623 9 SIDS 3,70

92/0657 13 SIDS 2,20

92/0743 48 SIDS 8,90

92/0795 9 SIDS 5,50

92/1049 4 Herzversagen bei kong. Herzfehler 16,50

92/1151 1 Kongenitale Herz- und Lebererkrank. 4,20

92/1184 13 SIDS 2,40

92/1243 22 SIDS 2,00

92/1424 65 Schädelhirntrauma 5,10

92/1442 65 Unfall/ Uberrollen 4,10

92/1509 7 SIDS 4,30

93/1820 00 SIDS 3,20

93/1878 14 SIDS 3,80

93/1964 0 Ersticken, vorher gesund 4,60

93/1988 3 SIDS 5,20

93/2027 3 SIDS 7,00

93/2219 13 SIDS 2,50

93/2242 SIDS 2,30

94/0018 CO SIDS 3,20

94/0107 12 SIDS 3,50

94/0147 22 SIDS 3,20

Tabelle 5: Quecksilberwerte der Münchner Fälle

Bei den Münchner SIDS fanden sich im Frontalhirn eine Spannbreite der Hg-Werte von 1,5 bis 24,6 ng/g Hg. Die Vergleichsfälle, darunter auch einige Fälle mit letztlich nicht gesicherter Diagnose, erbrachten Hg-Werte von 0,6 bis 25,8 ng/g Hg. In beiden Untergruppen zeigte sich eine linkssteile, nicht normalverteilte Anordnung der Quecksilberwerte mit einem Überwiegen von Werten zwischen nicht nachweisbar und 10 ng/g Hg.

Anzahl Fälle pro Quecksilbergruppe der Vergleichsfälle München, Frontalhirn

¦ Anzahl Fälle Pro Gruppe

0-4,99 10- 20-

14,99 24,99

Hg-Untergruppen ng/g Hg

Abbildung 6

Anzahl Fälle pro Quecksilbergruppe SIDS München,

Frontalhirn

¦ Anzahl Fälle pro Grupppe

0-4.99 10- 20-

14,99 24,99

Hg-Werte pro Untergruppe ng/g Hg

Abbildung 7

In Tab 6 finden sich die statistischen Kennwerte Median, Arithmetisches Mittel, Varianz und Standardabweichung für die gesamten Münchner Fälle sowie gesondert für die Untergruppen SIDS und Vergleichsfälle

Median Arithmetisches Mittel Varianz Standartabwei chung

München Alle Hg frontal (ng/g) 3,7 5,44 28,23 5,31

München SIDS Hg fontal (ng/g) 3,5 5,21 24,66 4,97

München Vergleichsfälle Hg frontal 4,2 5,95 33,79 5,81

Tabelle 6

Insgesamt lassen sich bei der großen Spannbreite und hohen Varianz bzw. Standardabweichung der Werte keine signifikanten Unterschiede zwischen den SIDS und den Vergleichsfallen in Bezug auf Höhe der Quecksilberkonzentrationen nachweisen. Im Vergleich der Berliner und Münchner Fälle zeigt sich im Mann-Whitney-U-Test jedoch eine hochsignifikante Differenz (p<0,01) mit deutlich höheren Quecksilberwerten in den Münchner Proben.

4.1.3 Korrelation der Quecksilberwerte mit dem Alter:

Eine Korrelation der Quecksilberwerte mit dem Alter ließ sich in keiner der Untergruppen nachweisen.

Berlin alle Fälle Korrelation Alter/Hg Frontalhirn

? Hg Großhirn

Abbildung 8

München alle Fälle Korrelation Alter/Hg Frontalhirn

• Hg Großhirn

Abbildung 9

4.2 Reaktive Astrogliose

Bei allen Fällen wurden histologische Präparate von Schnitten der Medulla oblongata auf Höhe des Nucleus dorsalis nervus Vagus und zusätzlich, da bei einigen Präparaten auf der Schnittebene der Nucleus N. IX. nicht getroffen war, von Schnitten im Bereich der Kerne der medianen Raphe von Pons bzw. Medulla oblongata untersucht. Angegeben wird jeweils die Gesamtsumme in Quadratmykrometer der GFAP-positiven Strukturen von jeweils vier Blickfeldern pro Schnitt.

Die Absolutwerte in µm2 für die Berliner Fälle finden sich in der Tabelle 7 (S. 67).

GZ- Lebensalter in Diagnose Glia Median

Nummer Wochen

B93/604 12 SIDS 84232

B93/623 20 SIDS 312412

B94/036 16 SIDS 197600

B94/051 10 SIDS 100400

B94/077 CT) Otitis media fehlt

B94/157 13 SIDS 18792

B94/217 49 Endokarditis fehlt

B94/262 50 SIDS fehlt

B94/502 37 Ertrinken fehlt

B94/547 30 Waterhouse-Friedrichsen-Syndrom fehlt

B94/655 16 SIDS fehlt

B94/658 14 SIDS fehlt

B94/695 15 SIDS fehlt

Tabelle 7

Die Absolutwerte in µm2 für die Münchner Fälle finden sich in Tabelle 8.

GZ-Nr Alter in Wochen Diagnose Glia mediane Raphe Glia MO

89/1270 52 Schädelzertrümmerung nach Unfall 111700 53913

89/1472 26 SIDS 89713 56273

89/1500 43 SIDS 52499

89/1523 65 Erwürgen 94926 22989

89/1938 43 SIDS 48122

89/2131 0 Ersticken 18255

89/2200 13 SIDS 149500 44786

90/0040 Ol SIDS 4666

90/0255 17 SIDS 9335

90/0415 35 SIDS 206300 34508

90/0450 78 Ertrinken 633100

90/0481 10 SIDS 309800

90/0558 13 SIDS 131500 85025

90/0637 104 Ersticken 182700

91/1357 43 SIDS 451400

91/1702 30 Schädelzertrümmerung nach Unfall 456400

91/1730 30 SIDS 45141 25117

91/1933 9 SIDS 7987 4830

91/2062 52 Schädelbasisbruch 42270

91/2359 26 SIDS 63403 82586

91/2361 co SIDS 14608

GZ- Alter in Diagnose Glia Glia MO

Nummer Wochen mediane Raphe

91/2422 22 SIDS 5411

91/2536 o SIDS 61847

92/0010 22 SIDS 36691 873

92/0044 7 SIDS 44794 9205

92/0111 9 SIDS 110300

92/0115 17 SIDS 53714 1217

92/0247 CD SIDS 91810 27193

92/0314 17 SIDS 164900

92/0320 CT) SIDS 67756

92/0385 16 SIDS 39990 96570

92/0405 78 Ersticken bei Laryngitis 269200 122100

92/0416 CD SIDS 138400

92/0482 30 SIDS 9268

92/0489 61 Ersticken 467700

92/0493 91 Ertrinken 428800

92/0560 13 SIDS 251400 115400

92/0565 26 SIDS 176800

92/0607 9 SIDS 33656

92/0623 CT) SIDS 141000 135000

92/0657 13 SIDS 53739

92/0743 48 SIDS 274200 310300

92/0795 CT) SIDS 42816

92/1184 CO SIDS 622100 65760

92/1243 22 SIDS 296300

92/1424 65 Schädelhirntrauma 84447

92/1442 65 Unfall mit Uberrollen 279200

92/1509 7 SIDS 271500

93/1820 00 SIDS 43310 16715

93/1878 14 SIDS 98635

93/1964 0 Ersticken, vorher gesund 17842 11211

93/1988 3 SIDS 28354 36606

93/2027 3 SIDS 26406

93/2219 13 SIDS 25086

93/2242 SIDS 25952 79342

94/0018 CO SIDS 11818

94/0107 12 SIDS 325900

94/0147 22 SIDS 39001

Tabelle 8

4.2.1 Vergleich der Stärke der reaktiven Astrogliose in der medianen Raphe zur Höhe der Quecksilberwerte im Frontalhirn:

4.2.1.1 Berlin

Da wegen der oben angesprochenen Probleme mit den unterschiedlichen Sekanten nur von fünf Berliner Fällen die Proben für die Histologie auf der richtigen Höhe entnommen worden waren, unterbleibt wegen der geringen Fallzahl der Versuch einer Korrelation von Gliareaktion und Quecksilberhöhe bei dieser Untergruppe.

4.2.1.2 München Gesamtgruppe

Untersucht man die Gesamtgruppe der Münchner Fälle auf eine für alle Werte gültige Korrelation zwischen Quecksilberhöhe und Fläche der reaktiven Astrozyten, so findet sich keine Korrelation.

Dies entspricht dem erwarteten Ergebnis. In dieser Altersgruppe ist mit einer Hintergrundprävalenz der reaktiven Astrogliose um 50 % zu rechnen (Kinney et al. 1992). Daher war nicht zu erwarten, daß eine möglicherweise beginnende Korrelation zwischen Quecksilberhöhe und Ausprägung der reaktiven Astrozytose bei Betrachutung der Gesamtzahl der Fälle von der starken Streuung der Hintergrundprävalenz abzutrennen wäre. Zudem ist nach den bisherigen Erfahrungen in einem etwas höheren, aber in der Größenordnung unseren Werten nahe kommenden Quecksilberdosisbereich trotz positiver Gliareaktion keine sichere Korrelation zwischen Quecksilberhöhe und Stärke der reaktiven Gliose gefunden worden (Lapham et al. 1995).

München (alle) 0-12 Monate Sterbealter Korrelation Hg-Werte Frontalhirn/Gliareaktion Mediane

Raphe

? Glia Median

Abbildung 10

Weniger eindeutig sind die Ergebnisse bei der Frage nach einer Grenzzone. Oberhalb einer solchen Grenzzone sind eine höhere relative Anzahl positiver Astrogliareaktionen zu fordern. Im Idealfall sollten überhaupt keine negativen Astrogliareaktionen mehr nachzuweisen sein.

Da es keine Vorarbeiten bezüglich eines Grenzwert zu einem beginnenden Effekt der Quecksilberwirkung auf das menschliche Gehirn im Sinne einer reaktiven Astrozytose gab, den wir in unserer Arbeit überprüfen konnten, mußten wir bei der Auswertung zweistufig vorgehen.

Zunächst mußte im explorativen Sinne eine Verdachtshypothese eines Grenzwertes in der untersuchten Population entwickelt werden. Danach mußte dieser fragliche Grenzwert statistisch überprüft werden.

Zur Hypothesengenerierung zogen wir die optische Auswertung der graphischen Darstellung des Verhältnisses von Quecksilberhöhe und Fläche der reaktiven Astrozyten heran sowie die mathematische Berechnung der relativen Anzahl positiver Astrogliareaktionen mit steigenden Quecksilberwerten.

Hier wurde nach Anhaltspunkten für die gegensätzlichen Hypothesen gesucht, ob es sich im untersuchten Kollektiv um eine reine Zufallsverteilung der Fläche der reaktiven Astrozyten im Sinne einer unspezifischen Hintergrundprävalenz handelt, oder ob ab einem bestimmten Quecksilberwert die Tendenz zu weniger negativen Gliarektionen zu vermuten ist. Es wurde also nach Hinweisen für folgende Nullhypothese gesucht: Es gibt keinen Quecksilberwert, oberhalb dessen nur noch positive Gliareaktionen zu finden sind. Die Alternativhypothese ist: Es gibt einen Quecksilberwert, oberhalb dessen nur noch positive Gliareaktionen zu finden sind.

Als Kriterium für eine positive Reaktion wählten wir eine Gliareaktion mit mehr als 100000 µm2.

München (alle) 0-24 Monate Sterbealter Korrelation Hg-Werte Frontalhirn/Gliareaktion Mediane

Raphe

Glia Median

Abbildung 11

Wie aus dem Diagramm zu entnehmen ist, verteilen sich die Flächen an reaktiven Astrozyten im unteren Quecksilberdosisbereich zufällig und ohne Zeichen eines Zusammenhanges zwischen Quecksilberhöhe und Stärke der Gliareaktion. Ab eines Quecksilberwertes von ca 8-9 ng/g wird der optische Eindruck erweckt, daß die Anzahl negativer Gliareaktionen abnimmt.

Diese Zone erfüllt am besten die Kriterien für einen möglichen Grenzbezirk innerhalb des untersuchten Kollektives bezüglich einer beginnenden Quecksilberwirkung auf die Astrozyten im Sinne der reaktiven Astrogliose.

Somit läßt sich aus der Graphik die Hypothese ableiten, daß sich ab einem Quecksilberwert von ca. 8-8,5 ng/g eine quecksilberbedingte Zunahme positiver Gliareaktionen abzeichnet.

Die oben erläuterte Hypothese besagt, daß ab einem Quecksilbergrenzwertbereich successive die relative Anzahl der positiven Reaktionen zunehmen müßte. Zur mathematischen Unterstützung der optischen Auswertung führten wir daher eine Berechnung des Verhältnisses von positiven Gliareaktionen (G+) zu der Gesamtzahl (n) an positiven und negativen Reaktionen mit steigenden Quecksilberwerten durch. Dabei wurde für jeden untersuchten hypothetischen Quecksilbergrenzwert zunächst die Anzahl positiver Gliareaktionen oberhalb dieses Quecksilberwertes bestimmt und dann durch die Gesamtzahl der Gliareaktionen oberhalb des jeweiligen Quecksilberwertes geteilt.

NgHg Negative Positive Gesamtzahl Verhältnis der

Frontalhirn Gliareaktionen Gliareaktione positiver und positiven

(G-) n(G+) negativer Reaktionen zur

Gliareaktionen Gesamtzahl

(n) (G+/n)

1 35 23 58 0,4

2 30 20 50 0,4

3 23 13 36 0,36

4 13 10 23 0,43

5 11 8 19 0,42

6 7 8 15 0,53

7 5 6 11 0,55

8 2 6 8 0,75

9 2 4 6 0,67

10 2 4 6 0,67

11 2 3 5 0,6

13 1 2 3 0,67

Tabelle 9

Verhältnis positiver Astrogliareaktionen zur Gesamtzahl der Fälle mit steigenden Quecksilberwerten

Abbildung 12

Auch in dieser Berechnung findet man einen relativen Anstieg der positiven Gliawerte im Quecksilberbereich um 7-9 ng/g Hg, so daß man einen Grenzwert etwa bei 8 ng/g Hg vermuten könnte.

Allerdings zeigt sich, wie zu erwarten, kein plötzlicher Sprung von einer zufallsverteilten relativen Anzahl an positiven Gliareaktionen zu 100 % positiven Reaktionen. Entsprechend der interindividuell unterschiedlichen Sensibilität auf Quecksilber ist eher von einem Grenzwertbereich mit successive sich verändernden relativen Häufigkeiten der positiven und negativen Reaktionen zu rechnen. Somit stellt sich jetzt die Frage, ob die zu beobachtende Tendenz statistisch signifikant wird, ob tatsächlich ein signifikanter Unterschied zwischen den Teilgruppen oberhalb und unterhalb des hypothetischen Grenzwertes besteht.

Diese Hypothese wurde mittels des Fischer-Yates-Test überprüft. Wir entschieden uns für dieses statistische Instrument, da wegen der geringen Fallzahl im Bereich der höheren Quecksilberwerte sowie der großen Streuung der Werte eine Berechnung der Korrelation als nicht sinnvoll erschien. Es wäre hier zu erwarten gewesen, daß der beginnende Effekt einer Korrelation von Quecksilber und Gliareaktion durch die Effekte anderer Ursachen einer Gliose überlagert würde. Dagegen kann eine Ja/Nein-Unterscheidung in dem Sinne getroffen werden, daß entweder eine relevante Astrogliose pro Einzelfall nachgewiesen werden kann oder aber nicht. Die Anzahl komplett negativer Reaktionen müßte im Grenzbereich abnehmen und dann mit steigender Quecksilberkonzentration sich asymptotisch Null annnähern, bzw. die Anzahl positiver Reaktionen successive zunehmen.

Die Nullhypothese ist hierbei: Die Populationen oberhalb und unterhalb des überprüften Quecksilberwertes entsprechen sich in der relativen Anzahl der positiven zu den negativen Gliareaktionen.

Die Alternativhypothese ist: Die Population oberhalb des zu untersuchenden Quecksilberwertes zeigt eine signifikant niedrigere relative Anzahl an negativen Gliareaktionen als die Population unterhalb des zu prüfenden Grenzwertes.

In die statistische Auswertung wurden in einer ersten Berechnung alle Münchener Fälle mit einem Sterbealter von 0-24 Monate aufgenommen, danach erfolgte eine getrennte Berechnung für die Altersgruppe von 0-12 Monate.

Auswertungstabelle für den Fischer-Yates-Test

Tatsächlich gefundene Werte, München, alle Fälle 0-24 Monate

Fläche reaktiver Fläche reaktiver Zeilensumme

Astrozyten Astrozyten

< 100.000 µm2 > 100.000 µm2

Quecksilber 33 16 49

Frontalhirn <8

ng/g

Quecksilber 2 7 9

Frontalhirn >8

ng/g

Spaltensumme 35 23 58 Gesamtsumme

Tabelle 10

Aus der Berechnung der tatsächlichen Verteilung der Werte sowie aller im Sinne der Alternativhypothese extremeren möglichen Verteilungen folgt eine Wahrscheinlichkeit von p=0,015, daß die Nullhypothese zutrifft. Somit findet sich eine statistisch signifikant niedrigere relative Anzahl von negativen Gliareaktionen in der Gruppe oberhalb des Quecksilberwertes von 8 ng/g.

Auch für die Untergruppe mit Sterbealter 0-12 Monate ergibt sich ein signifikantes Ergebnis im Sinne der Alternativhypothese mit p=0,0085.

4.2.1.2.1 SIDS

Auch bei Betrachtung nur der Untergruppe der SIDS findet sich bei gleichem Vorgehen im Fischer-Yates-Test mit einer Wahrscheinlichkeit von p=0,0149 eine signifikant niedrigere Anzahl negativer Gliareaktionen in der Gruppe mit Quecksilberwerten über 8 ng/g. Zur Veranschaulichung siehe Abb. 16

München (SIDS) Korrelation Hg Frontalhirn/Gliareaktion Mediane Raphe

? Glia Median

Abbildung 13

4.2.1.2.2 Vergleichsgruppe

Auch in der Vergleichsgruppe entsteht der Eindruck, daß in den höheren Dosisbereichen weniger negative Gliareaktionen zu finden sind als im unteren Bereich. Wegen der geringen Fallzahl in dieser Gruppe ist diese Aussage jedoch kaum zu erhärten, und das Ergebnis ist auch rechnerisch nicht statistisch signifikant.

München (Vergleichsgruppe) Korrelation Hg Frontaihirn/Glia Median

? Glia Median

Abbildung 14

4.2.2 Korrelation der Stärke der Astrogliareaktion im Nucleus dorsalis nervus vagus mit der Quecksilberhöhe im Frontalhirn

Bei insgesamt um den Faktor 1,5-2 niedrigeren Werten der Flächen reaktiver Astrozyten findet man bei der Analyse der Gliareaktion im Bereich des Nucleus dorsalis nervus vagi ein ähnliches Phänomen wie bei der Gliareaktion der medianen Raphe. Sowohl in der Gesamtgruppe wie auch in den Untergruppen SIDS und Vergleichsgruppe finden sich ab einem bestimmten Quecksilberwert - hier allerdings 5 ng/g - eine Tendenz zu weniger negativen Gliareaktionen.

Aufgrund der relativ kleinen Fallzahl verzichteten wir hier jedoch auf das oben beschriebene statistische Vorgehen. Siehe Abb. 15

München (alle) Korrelation Hg-Werte Frontalhirn/Gliareaktion Nucleus motorius nervus X.

? Glia MO

Abbildung 15

München (SIDS) Korrelation Hg-Werte Frontalhirn/Gliareaktion Nucleus motorius nervus X.

? Glia MO

Abbildung 16

4.2.3 Korrelation zwischen dem Alter der Fälle und der der Stärke der Astrogliareaktion

Eine Korrelation der Gliareaktion mit steigendem Alter innerhalb des ersten Lebensjahres konnte in keiner der Gruppen nachgewiesen werden.

München (alle) Korrelation Alter/Gliareaktion Mediane Raphe

? Glia Median

Abbildung 17

Allerdings zeigt sich eine Tendenz, daß ab einem Alter von etwa 70 Wochen keine negativen Gliareaktionen mehr zu finden sind.

4.2.4 Allgemeine Verteilung:

Im Überblick findet man, entsprechend den Angaben in der Literatur (Levis und Cowan 1985), immer eine relativ deutlich vermehrte Fläche mit GFAP-positiven Astrozyten an der Grenze zum Liquorraum sowie subependymar im Bereich der Glia limitans. Die Weiße Substanz zeigt in der Regel eine stärkere Reaktion als die Graue Substanz. Die Mittellinie weist sowohl vom Ependym her als auch in der Raphe eine deutliche positive Farbreaktion aus (siehe Abb. 18, 19 und 20).

Abb. 18 (S 77): Übersichtsbild (1:100) in Höhe des Nucleus dorsalis nervus vagus mit Darstellung der ausgeprägten Astrogliose der Glia limitans und Betonung im Bereich der weißen Substanz

Abbildungen 19,20: Ausgeprägte Gliareaktion im Bereich der Glia limitans und der medianen Raphe

4.2.5 Verhältnis Stärke der Astrogliosereaktion Mediane Raphe/Nucleus motorius n. X

In der Medulla oblongata findet man überwiegend eine ausgeprägtere Gliareaktion in der medianen Raphe als im Nucleus dorsalis n X

Das Verhältnis der in unserer Arbeit gefundenen Relationen der Fläche der reaktiven Astrozyten von Medianer Raphe und Nucleus dorsalis n X wird in Abb 21 gezeigt. Dargestellt wird das Verhältnis für alle Einzelfälle, bei denen sowohl histologische Schnitte von der medianen Raphe als auch vom Nucleus dorsalis n. X vorhanden waren

Abbildung 21

5.1.3 Einordnung der eigenen Ergebnisse in den aktuellen Stand der Forschung 5.1.3.1 Methyl-Quecksilber

Die bisher gültigen Korrelationen zwischen Methyl-Quecksilberbelastung und Effekten bei intrauterin belasteten Feten stammen letzlich alle aus den statistischen Auswertungen der Vergiftungsperiode im Irak (Marsh et al. 1981, 1987, WHO1990, Gilbert und Grant-Webster 1995), siehe auch Kapitel 1.1.7.1 und 1.1.8. Während allerdings die Effekte der höheren Belastungsgruppen mit deutlichen neurologischen Auffälligkeiten der Kinder und Methylquecksilberwerten von über 165 µg/g Haarquecksilber der Mütter gut gesichert sind, bleiben wegen der damals geringen Fallzahlen im Niedrigdosisbereich Unsicherheiten, welcher Quecksilberdosisbereich noch als sicher anzusehen ist oder von welchem Bereich an erste Quecksilbereffekte auftreten.

In der Auswertung der Daten von Erwachsenen Opfern der Vergiftungsperioden aus Minamata und aus dem Irak folgte die WHO (1976) zunächst einem parametrischen statistischen Modell von Bakir et al. (1973), mit welchem für jedes einzelne Symptom der Quecksilberintoxikation eine Dosis-Antwort-Kurve sowie ein „praktischer Grenzwert" berechnet wurde. Es handelt sich dabei um das sogenannte„Hockeyschlägermodell", bei dem die waagerechte, der x-Achse parallele Linie die Hintergrundprävalenz eines unspezifischen Symptomes angibt, und die aufsteigende Linie die logarithmische Korrelation der Auftretenswahrscheinlichkeit des Symptomes in Bezug auf die Quecksilberkonzentration angibt. Der Eckpunkt bzw. Treffpunkt zwischen waagerechter und aufsteigender Linie wird dann als „praktischer Grenzwert" - im Sinne von praktisch detektabel - definiert.

Abbildung 24:

Darstellung des Logit- und des „Hockeyschläger"-Modells über das Dosis-Antwortverhältnis zwischen verspätetem Laufen und der maximalen mütterlichen Methylquecksilberkonzentration im Haar während der Schwangerschaft. Die beiden Dosis-Antwortkurven sind mit soliden Linien dargestellt, die gestrichelte Fläche repräsentiert die 95%-Konfidenzintervalle.

Dies Modell beinhaltet, daß bei steigender Hintergrundprävalenz, also bei einer graphisch bei einem höheren Wert die y-Achse schneidenden waagerechten Geraden.

Daunderer:

Je mehr Amalgam die Mütter hatten, desto höher war Quecksilber im Gehirn.

Über 7 µg/g Hg trat eine relative Aotrogliose auf (Astrozytenschädigung),

die bei hohen Werten zum Atemstillstand führt (Schlafapnoe).